热 烈 祝 贺我刊1篇论文荣获第五届中国科协优秀科技论文遴选计划优秀论文为勉励科技事情者多出科研精品和原创性研究结果，引导更多优秀结果在我国科技期刊首发，助推世界一流科技期刊建设，中国科协组织开展了第五届优秀科技论文遴选计划。经由各学科领域专家推荐、初评遴选、终评审定并向社会公示，最终确定96篇入选论文。本届入选的96篇论文是2016年1月1日以来，揭晓在我国科技期刊上的优秀论文的代表。
人民卫生出书社系列期刊《肿瘤综合治疗电子杂志》2019年5卷第2期揭晓的《希望期胃癌中EB病毒熏染率及EB病毒到场免疫调治的机制探索》乐成入选第五届中国科协优秀科技论文遴选计划优秀论文。这是继我刊2019年1篇论文荣获“2019年度百篇中华医学优秀论文”和2020年1篇论文荣获“2020年度百篇中华医学优秀论文”后的又一项殊荣！作为本次入选的海内唯一一本肿瘤类科技期刊和医学电子期刊，这对我们既是一种勉励，也是一种推动。
我们将不忘初心，牢记使命，斗胆探索，努力践行人民卫生出书社强社强刊生长战略，吸引更多优秀论文揭晓在我刊上，向海内一流科技期刊行列迈进。希望期胃癌中EB病毒熏染率及EB病毒到场免疫调治的机制探索李北芳1，杨菁1，张朦琦1，陈祖华1，李忠武2，董彬2，高静1 （1．北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所 消化肿瘤内科 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142 ；2．北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所 病理科 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142） 【摘要】 目的 分析希望期胃癌中EBV阳性率及EBV到场机体免疫调治的可能机制。方法 99例希望期胃癌患者入选该研究，收集患者化疗前肿瘤组织标本99例和化疗后肿瘤组织标本108例，以及相应61例人源化胃癌移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）组织，用显色原位杂交方法检测所有组织中EBV-RNA（EBER）状态；荧光定量PCR法检测患者血浆及淋巴细胞中EBV-DNA拷贝数；在胃癌细胞AGS中导入EBV相关BZLF1卵白构建EBV阳性细胞，RNA测序方法分析EBV阴性及阳性胃癌细胞中差异表达的分子或通路，尤其是跟免疫相关的通路。效果 99例希望期胃癌患者化疗前标本中EBV阳性率为1.01%（1/99），且EBV状态不受化疗影响，PDX组织中EBV阳性率高达21.31%（13/61）。
在8例原发肿瘤组织EBV阴性而相应PDX组织EBV阳性的患者中，5例（62.50%）患者的外周血存在EBV潜伏熏染。胃癌细胞AGS中导入BZLF1卵白后，与其配对的亲本细胞相比，筛选出差异表达分子537个，其中上调表达分子265个，下调表达分子272个，通路富集分析讲明，上调通路有Jak-STAT通路、PPAR通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路等，这几条通路均与免疫调治相关。结论 我国希望期胃癌中EBVaGC比例较低，PDX组织中EBV阳性率较高可能是由于小鼠免疫缺陷促进潜伏熏染的EBV激活复制，EBV熏染可能通过激活机体固有免疫而从免疫治疗中获益，确切机制有待深入探索。
【关键词】 EBV相关性胃癌；EBV潜伏熏染；免疫调治2014年癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）首次提出胃癌分子分型包罗EBV相关性胃癌（Epstein-Barr virus associated gastric carcinomas，EBVaGC），约占整体胃癌的8%～10%[1]，因是法式性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）/法式性死亡卵白配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）免疫抑制剂治疗的适宜群体而广受关注。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是首个被发现的致瘤性DNA病毒，人体潜伏熏染率为90%以上[2]，EBV相关性肿瘤凭据潜伏期表达产物差别可分为Ⅰ～Ⅲ型，EBVaGC属于Ⅰ或Ⅱ型。EBV可在人体内恒久潜伏存在，可能是由于病毒产物的免疫原性较弱或抑制了机体免疫系统而造成免疫逃逸，但在特定情况下EBV可激活表达马上早期卵白——BZLF1卵白，病毒扩增进入裂解复制期，进而形成EBV相关性肿瘤。全球每年约有20万新增EBV相关恶性肿瘤患者[3]。
虽然EBVaGC的比例屡有报道，但现在晚期胃癌中EBVaGC比例报道纷歧，治疗是否会改变EBV熏染状态也未知。作为嗜淋巴细胞的外源致癌物，有报道EBV与60%～80%的混淆细胞型及20%～40%的结节硬化型霍奇金淋巴瘤相关，与40%的免疫缺陷型Burkitt淋巴瘤相关。在恒久病毒携带者中，EBV与自身免疫性疾病如多发性硬化症的生长有关；在实体器官或造血干细胞移植后的免疫抑制个体中，EBV熏染会导致移植后淋巴增殖性疾病或弥漫性大B细胞淋巴瘤，有1%～20%患者泛起EBV相关恶性肿瘤[4]。
除了EBV相关的B细胞淋巴瘤，EBV还可熏染其他淋巴细胞，包罗T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞。有研究讲明EBV熏染后可导致宿主细胞的表观遗传改变，进而使抑癌基因缄默沉静，促使细胞癌变。也有研究讲明EBV熏染后引起的宿主抗病毒天然免疫应答（TBK1-IRF3信号通路）可促进Hippo信号通路中关键转录激活子YAP的入核活化，从而促进了肿瘤细胞的增殖能力[5]。EBV熏染上皮细胞的可能机制是与转化的淋巴细胞接触造成，熏染后病毒与机体免疫系统（包罗固有免疫和适应性免疫）之间的调治在维持潜伏熏染和致瘤历程中至关重要。
本研究旨在探索希望期胃癌中EBVaGC的比例以及EBV熏染后到场免疫调治的可能分子机制。1 质料与方法1.1 质料1.1.1 患者和组织样本 选取2012年6月至2015年12月于本院接受治疗的99例依据NCCN胃癌指南诊断为希望期胃癌的患者作为研究工具，所有患者均具有治疗前内镜活检肿瘤组织样本（n＝99），其中75例患者具有配对的治疗后内镜活检肿瘤组织样本（n＝108）。
99例患者中有61例患者具有相应的人源化胃癌移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）组织样本（PDX相关详见前期报道[6]）。8例患者治疗前及治疗历程中的血浆与淋巴细胞为科室前期生存标本。本研究所有患者均签署了科研样本使用知情同意书，同意其样本用于后续研究。
1.1.2 实验动物及胃癌细胞系 本研究实验动物接纳5～6周龄、体重18～20 g的雌性非肥胖糖尿病/严重团结免疫缺陷（non-obese diabetic/server combined immune-deficiency，NOD/SCID）小鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司）。人胃癌细胞系AGS由北京大学肿瘤医院消化内科实验室生存。
1.1.3 试剂 EBER显色原位杂交试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司）；EB病毒核酸检测试剂盒（苏州天隆科技公司）；BZLF1过表达和对照慢病毒载体（北京Gene Copoeia公司）；10%胎牛血清（Gibco公司）；RPMI 1640造就基（Gibco公司）；嘌呤霉素（美国Sigma公司）；抗体IL-6、Jak2、pJak2、Stat3、pStat3、兔二抗和鼠二抗（美国CST公司），β-actin抗体（美国Sigma公司），BZLF1抗体（Santa Cruz公司）；化学发光试剂（普利莱公司）。1.2 方法1.2.1 组织EBER显色原位杂交 凭据EBER显色原位杂交试剂盒说明操作，大致流程为：①4 μm厚石蜡包埋组织切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡、水化；②卵白酶消化；③地高辛标志EBER探针杂交；④HRP标志抗地高辛抗体孵育；⑤DAB显色。EBV阳性界说为EBER核表达占肿瘤细胞的20%及以上[7]。所有组织切片染色效果由两位专职病理人员独立判读。
1.2.2 BZLF1稳定表达胃癌细胞系的构建与造就 将带有GFP荧光标志和嘌呤霉素筛选基因的BZLF1过表达慢病毒载体及对照载体转染24孔板中处于对数生恒久的AGS细胞，使用嘌呤霉素筛选细胞3周并定时显微镜下视察细胞荧光状态以筛选稳定转染细胞系。胃癌细胞及其稳定转染细胞系均造就于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全造就基中，置于37℃、5%CO2孵箱中造就。1.2.3 血浆和外周血淋巴细胞DNA提取及EBV-DNA检测 本实验接纳EB病毒核酸检测试剂盒举行检测，原理为针对EBV的守旧基因片段设计特异引物及特异Taqman探针以检测样本中EBV-DNA拷贝数。
大致步骤为：①取前期生存的患者血浆和淋巴细胞各50 μL，划分加入50 μL核酸提取液，混匀后2000 转/min，离心10 s；②100℃水浴中孵育10 min，12000 转/min，离心10 min，上清为DNA，供聚合酶链反映（polymerase chain reaction，PCR）用；③根据荧光定量PCR要求配制20 μL反映体系。凭据临床诊断尺度，血浆或外周血淋巴细胞中任一EBV-DNA滴度高于10.0 copies/ml则界说为EBV潜伏熏染。1.2.4 RNA测序及生物信息学分析 本研究的RNA测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，大致流程为：①提取细胞总RNA后，通过Oligo（dT）磁珠富集带有polyA尾的mRNA并将其随机打断；②以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后降解RNA链并在DNA聚合酶Ⅰ体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链；③纯化后的双链cDNA经由末了修复、加A尾并毗连测序讨论后，举行PCR扩增并纯化PCR产物，获得文库；④对文库有效浓度举行准确定量（有效浓度高于2 nmol/L），以保证文库质量，质检及格后，举行Illumina HiSeq测序；⑤对测序效果举行后续的生物信息学分析。
R语言绘制差异表达分子火山图，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析差异表达基因富集通路。1.2.5 Western blot 提取胃癌细胞总卵白后，BCA法测定卵白浓度。
40 μg卵白样品于10%SDS凝胶中电泳分散后转移至硝酸纤维素膜，5%胎牛血清室温下抗原关闭1小时，4℃孵育一抗留宿，二抗室温孵育1小时后，ECL法显色。1.2.6 统计学分析 接纳SPSS 21.0统计软件举行数据分析，原发肿瘤组织与PDX组织中EBER阳性率差异使用方差分析，P＜0.05代表效果具有统计学意义。2 效果2.1 患者临床病理特征和组织样本 纳入本研究的99例希望期胃癌患者筛选流程见图1。所有患者均具有化疗前内镜活检肿瘤组织样本（n＝99），其中45例患者具有配对的化疗后一次肿瘤组织样本，30例患者具有配对的化疗后≥2次肿瘤组织样本，共207份内镜活检肿瘤组织样本用于后续研究。
99例患者中，61例患者具有配对的PDX组织，用于后续研究。所有患者的性别、年事、原发肿瘤部位、分化水平、Lauren分型、转移情况、HER2表达及治疗情况详见表1。2.2 EBER在患者肿瘤组织和PDX组织中的表达 99例希望期胃癌患者化疗前肿瘤组织中，EBER阳性者仅1例（1.01%），且该患者药物治疗2周期和4周期后的肿瘤组织样本均为EBER阳性，其他治疗前EBER阴性患者治疗后的肿瘤组织中也均为阴性（图2），说明药物治疗对患者体内生长的肿瘤组织EBER状态无影响。而在61例PDX组织中，EBER阳性者有13例（21.31%），显着高于患者原发肿瘤组织（P＜0.05）。
2.3 患者血浆和外周血淋巴细胞EBV-DNA检测 为探索PDX组织中EBER阳性率高于其配对患者原发组织的可能原因，在原发肿瘤组织EBV阴性而相应PDX组织EBV阳性的患者中，8例患者具有生存的血浆和外周血淋巴细胞，对其举行EBV-DNA检测。在血浆和淋巴细胞EBV-DNA拷贝数的检测中，单独血浆阳性者有1例（例4），单独淋巴细胞阳性者有3例（例2，3，5），二者均阳性者1例（例1），说明共5例患者存在EBV潜伏熏染（图3）；其余3例患者（例6，7，8）的血浆和淋巴细胞中均未检测到EBV-DNA。例1中，患者治疗前和治疗348天后的两次原发肿瘤活检均为EBER阴性，但在相应的PDX组织中均转为阳性，提示肿瘤生长情况的免疫状态改变可能促进EBV复制。
2.4 EBV熏染到场免疫调治的可能分子机制 胃癌细胞AGS中导入BZLF1卵白后，与其配对的亲本细胞相比，筛选出差异表达分子537个，其中上调表达分子265个，下调表达分子272个（图4A）。通路富集分析讲明，上调通路有Jak-STAT通路、过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）通路等（图4B），这几条通路均与免疫调治相关，说明EBV熏染可能通过激活胃癌细胞固有免疫到场免疫调治。为了证实筛选效果，联合文献报道对其中的Jak-STAT通路举行了验证，Western blot效果证实，胃癌细胞中导入BZLF1后，Jak2和Stat3的磷酸化水平显著上调（图4C）。
3 讨论2014年TCGA基于分子分型提出了EBVaGC，现在该类型患者已被临床广泛关注[8]。研究报道EBV作为具有免疫原性的致瘤病毒，熏染人体后可恒久维持潜伏熏染，但在某种情况下也可激活复制进而形成肿瘤。本研究发现EBVaGC在我国希望期胃癌中比率很低（1.01%），且在患者体内肿瘤EBV状态比力稳定，而在相应的PDX组织中阳性率却显著升高（21.31%）。研究发现，在原发肿瘤组织EBV阴性而PDX组织中转为阳性的患者中，有62.50%患者血液中存在EBV潜伏熏染，推测移植瘤组织生长于免疫缺陷的NOD/SCID小鼠体内，小鼠免疫防御能力减低可能是促进潜伏熏染的EBV复制激活进而形成肿瘤的原因。
BZLF1是EBV马上早期卵白，是EBV由潜伏期进入裂解复制期进而致瘤的启动卵白。胃癌细胞中导入BZLF1后，PPAR信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路泛起显着上调。PPARs是核受体超家族的配体激活转录因子，近年有报道发现其在免疫调治中发挥重要作用，可调治树突状细胞的分化和成熟，抑制T细胞增殖、抑制炎症因子发生、到场Th1/2细胞的分化[9]，这也提示特异性抗体和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的杀伤作用受到抑制可促进肿瘤形成。T淋巴细胞活化的关键是控制淋巴细胞早期分化反映的IL-2基因的表达。
研究讲明PPARγ活化后可通过抑制IL-2基因表达从而抑制T淋巴细胞的早期活化、抑制T细胞增殖和炎症因子发生，提示使用PPAR抑制剂或提高IL-2基因表达可能成为治疗T细胞介导疾病的潜在治疗选择[10]。此外，本研究发现，虽然血液中EBV-DNA滴度在疾病生长历程中发生了改变，但EBV状态在患者体内肿瘤组织中却难以改变，或是因为相比于血液中游离的DNA片段，EBV熏染转化后可随宿主细胞一同复制而难以清除，这也提示监测血液中EBV滴度的须要性及预防EBVaGC发生的可行性。现在，有研究报道对于无症状的EBV携带者，使用针对病毒包膜卵白gp350疫苗发生中和性抗体可淘汰鼻咽癌的发病风险以及淘汰78%的感染性单核细胞增多症发生[11]，但对于已发生细胞转化的EBV作用甚微。
治疗性疫苗的目的是诱导特异性体液或细胞免疫发挥更强的免疫杀伤作用，识别和清除EBV熏染的B细胞和肿瘤细胞。研究讲明，运用携带EBNA1/LMP2或两者共表达的自体树突状细胞作为载体，可增强免疫原性进而激活抗原特异性CTL，也有直接运用基因修饰CTL（即过继T细胞免疫疗法）用于鼻咽癌（NCT01800071和NCT01094405）和移植后淋巴增殖性疾病的治疗[12,13]，且显示了良好效果，但对EBVaGC的治疗作用尚不明确。由于EBVaGC具有免疫检查点PD-L1高表达的特点，或许抗原特异性CTL团结PD-1/L1抑制剂可提高机体免疫状态，成为治疗EBVaGC的新计谋，现在也有相关临床研究（NCT03044743[14]），效果值得期待。本研究首次在希望期胃癌患者肿瘤组织、配对PDX组织及患者血液中检测了EBV状态，并对EBV阴性及阳性胃癌细胞的差异表达分子举行分析，讲明肿瘤免疫微情况和机体免疫防御系统与EBV熏染的相互作用。
免疫防御降低可能促进EBVaGC的发生生长，也提示治疗历程中应关注调动和激活患者免疫系统，而不仅是针对肿瘤自己。本研究仅凭据开端效果举行了推测，EBV熏染如何调控机体免疫系统尚需深入细致的研究。
引用本文:李北芳, 杨菁, 张朦琦, 等. 希望期胃癌中EB病毒熏染率及EB病毒到场免疫调治的机制探索[J]. 肿瘤综合治疗电子杂志, 2019, 5(2): 18-23.肿瘤综合治疗电子杂志简介《肿瘤综合治疗电子杂志》是创刊于2015年10月的季刊。自2018年1月至今，在主编沈琳教授和新一届编委会全体专家的配合努力下，我刊坚持执行主编＋重点号专题制度，期刊各项评价指标等综合影响力稳步提升，2019年和2020年一连2年荣获“中华医学百篇优秀论文”，2020年荣获第五届中国科协优秀科技论文遴选计划优秀论文；新媒体建设结果喜人，学术运动有序开展，已开端形成刊、书、网、学术营销全方位互动的创新融合出书模式，取得了良好的社会效益。
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